دانشکده کشاورزی
گروه علوم باغبانی
پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته علوم باغبانی
گرایش گیاهان دارویی
بررسی فاکتورهای مؤثر در باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان (Carum copticum L.)
اساتید راهنما:
دکتر بهمن حسینی
دکتر زهره جبارزاده
تحقیق و نگارش:
منصوره صالحی
تابستان 1391
چکیده
زنیان (Carum copticum L.) گیاهی یکساله و متعلق به تیره چتریان است که در ایران، هند، مصر و اروپا می روید. در میان گیاهان دارویی و معطر، زنیان گیاهی است که مطالعات و تحقیقات کمی بر روی آن انجام گرفته است. هدف این تحقیق، شناسایی بهترین ژنوتیپ، مناسب ترین ریزنمونه، بهترین ترکیب هورمونی و شرایط مناسب محیطی، جهت باززایی مستقیم کشت درون شیشه ای زنیان بود که در سه آزمایش جداگانه بصورت کاملاً تصادفی و فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. در آزمایش اول اثر غلظت های مختلف BAP (صفر، 2/2، 4/4 و 8/8 میکرومولار) به تنهایی یا در ترکیب با IAA (5/0، 1/1 و 2/2 میکرومولار) با ریزنمونه نوک شاخه از ژنوتیپ ارومیه مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج این آزمایش آشکار ساخت، بیشترین درصد باززایی (5/97 درصد) در تیمارهای 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 5/0 میکرومولار IAA بدست آمد. بیشترین میانگین باززایی (9/19 گیاهچه در هر ریزنمونه) هم در تیمار 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 5/0 میکرومولار IAA مشاهده شد. در آزمایش دوم اثر 4 ریزنمونه مختلف (کوتیلدون، هیپوکوتیل، گره و نوک شاخه)، با محیط های هورمونی مختلف (غلظت های صفر، 4/4 و 8/8 میکرومولار BAP در ترکیب با 5/0، 1/1 و 2/2 میکرومولار IAA) بر باززایی مورد استفاده قرار گرفت. نتایج آزمایش نشان داد که حداکثر درصد و میانگین باززایی در ریزنمونه نوک شاخه با 01/81 درصد و میانگین 6/19 گیاهچه در محیط MS همراه با 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 5/0 میکرومولار IAA بدست آمد. ریزنمونه های کوتیلدون و هیپوکوتیل باززایی نداشتند. در آزمایش سوم اثر ژنوتیپ های مختلف (ارومیه، اصفهان و مشهد) با غلظت های مختلف BAP (صفر، 4/4 و 8/8 میکرومولار) و TDZ (صفر، 4/4 و 8/8 میکرومولار) در ترکیب با IAA (5/0 میکرومولار) مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد بیشترین درصد باززایی (14/86 درصد) و میانگین باززایی (3/19 گیاهچه در هر ریزنمونه) در ژنوتیپ ارومیه در محیط حاوی 4/4 میکرومولار BAP در ترکیب با 5/0 میکرومولار IAA بدست آمد. همچنین ریشه زایی گیاهچه های باززایی شده در محیط های MS و 1/2MS همراه شده با صفر، 5/0 و 1 میلی گرم در لیتر IAA و IBA مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد بیشترین درصد ریشه زایی (100 درصد) در محیط MS همراه با 1 میلی گرم در لیتر IBA اتفاق افتاد. بیشترین طول ریشه در محیط MS بدون هورمون با 84/2 سانتی متر مشاهده شد.
کلمات کلیدی: زنیان، باززایی مستقیم، نوک شاخه، BAP.
تقدیم به:
بارگاه ملکوتی ثامن الحجج (ع).
تقدیم به:
مادرم….
دریای بی کران فداکاری و عشق
که وجودم برایش همه رنج بود
و وجودش برایم همه مهر
پدرم….
که از نگاهش صلابت
از رفتارش محبت
و از صبرش ایستادگی آموختم
برادر و خواهران عزیزم
که ادراک لحظات ناب باور بودن، لذت داشتن
و عظمت رسیدن به تمام تجربههای ارزنده زندگیم
مدیون حضور سبز آنهاست.
تشکر و قدردانی
” من لم یشکر المخلوق لم یشکر الخالق”
با سپاس از درگاه خداوند که نعمت علم و پژوهش را به من عطا فرمود و توفیق یافتم تحصیلات خود را در این مقطع به پایان برسانم. لازم می دانم از کلیه کسانیکه به نحوی در انجام این پژوهش همکاری و مساعدت داشته اند بدینوسیله تشکر و قدر دانی نمایم، به ویژه از جناب آقای دکتر بهمن حسینی استاد راهنمای اینجانب که با راهنمائیهای ارزشمندشان در مراحل مختلف انجام این تحقیق مرا همواره مورد لطف خویش قرار داده اند. همچنین از جناب آقای دکتر زهره جبارزاده استاد راهنمائی دوم تشکر و قدر دانی می نمایم.
از دیگر دوستان و عزیزان در گروه باغبانی جناب آقای دکتر رسول جلیلی مرندی، دکتر حسنی، دکتر اصغری که طی مدت تحصیل از معلومات ارزشمند ایشان بهره و حظ فراوان گرفته ام مراتب سپاس و ارادت بجای می آورم.
از مساعدت و همکاریهای خانم مهندس آقایی مسئول آزمایشگاه و دوستان عزیزم خانم مهندس قنبری، خانم مهندس قربانی و خانم مهندس مرادی پور و پژوهشکده زیست فن آوری دانشگاه ارومیه، تشکر و قدر دانی می نمایم.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول
1- مقدمه و کلیات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1
1-1- گیاهان دارویی………………………………………………………………………………………………………………………………………………1
2-1- کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………………………………………………2
3-1- خصوصیات گیاهشناسی زنیان……………………………………………………………………………………………………………………..3
4-1- تاریخچه و پراکنش گیاه زنیان…………………………………………………………………………………………………………………….3
5-1- نیازهای اکولوژیکی زنیان……………………………………………………………………………………………………………………………..4
6-1- ترکیبات شیمیایی گیاه………………………………………………………………………………………………………………………………..4
7-1- خواص درمانی………………………………………………………………………………………………………………………………………………5
8-1- کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………………………………………………………………..6
9-1- کاربردهای کشت بافت گیاهی در کشاورزی………………………………………………………………………………………………..7
10-1- روش های مختلف کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………………………………7
11-1- ریزازدیادی………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8
12-1- تمایز سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………………………9
13-1- تمایز اندام…………………………………………………………………………………………………………………………………………………9
14-1- اندام زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………….10
1-14-1- اندام زایی از بافت کالوس………………………………………………………………………………………………………………….11
2-14-1- اندام زایی نابجا بطور مستقیم……………………………………………………………………………………………………………13
15-1- هدف از انجام این تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………13
فصل دوم
2- بررسی منابع علمی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
1-2- ریزازدیادی………………………………………………………………………………………………………………………………………………14
2-2- باززایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..14
3-2- ریزازدیادی………………………………………………………………………………………………………………………………………………15
4-2- اثرات نوع ریزنمونه بر باززایی………………………………………………………………………………………………………………….15
5-2- ژنوتیپ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………19
6-2- تنظیم کننده رشد………………………………………………………………………………………………………………………………….20
7-2- ریشه زایی………………………………………………………………………………………………………………………………………………23
فصل سوم
3- مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26
1-3- مکان و زمان انجام تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………26
2-3- آماده سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………………………………………….26
1-2-3- محلول های ذخیره مواد معدنی محیط کشت MS………………………………………………………………………….27
3-3- محلول های ذخیره هورمون……………………………………………………………………………………………………………………28
4-3- سایر مواد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………28
5-3- ضدعفونی نمودن نمونه ها………………………………………………………………………………………………………………………28
6-3- کشت بذور و شرایط نگهداری و رشد……………………………………………………………………………………………………..28
7-3- آزمایشات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………29
1-7-3- آزمایش اول: بررسی اثرات نوع محیط هورمونی بر باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان…………………..29
2-7-3- آزمایش دوم: بررسی اثرات ریزنمونه بر باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان……………………………………..29
3-7-3- آزمایش سوم: بررسی اثر ژنوتیپ های مختلف بر میزان باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………29
8-3- ریشه زایی……………………………………………………………………………………………………………………………………………….29
9-3- سازگاری………………………………………………………………………………………………………………………………………………….29
10-3- تجزیه و تحلیل آماری داده ها و نرم افزارهای مورد استفاده………………………………………………………………29
فصل چهارم
4- نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………31
1-4- آزمایش اول: بررسی اثرات نوع محیط هورمونی بر میزان باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان با استفاده از ریزنمونه نوک شاخه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………31
1-1-4- اثر غلظت های مختلف بنزیل BAP در ترکیب با IAA بر درصد باززایی شاخساره در گیاه زنیان…..33
2-1-4- اثر غلظت های مختلف BAP در ترکیب با IAA بر میانگین باززایی شاخساره گیاه زنیان………………34
2-4- آزمایش دوم: بررسی اثرات نوع ریزنمونه بر باززایی درون شیشه ای گیاه زنیان………………………………………..36
1-2-4- اثر ریزنمونه های مختلف بر درصد باززایی شاخساره……………………………………………………………………………..38
2-2-4- اثر ریزنمونه های مختلف زنیان بر میانگین باززایی شاخساره………………………………………………………………..39
3-4- آزمایش سوم: بررسی اثر ژنوتیپ های مختلف بر میزان باززایی درون شیشه ای زنیان………………………………41
1-3-4- اثر ژنوتیپ بر درصد باززایی شاخساره………………………………………………………………………………………………….43
2-3-4- اثر ژنوتیپ های مختلف زنیان بر میانگین باززایی در هر شاخساره…………………………………………………………44
4-4- اثر غلظت های مختلف IBA و IAA بر ریشه زایی……………………………………………………………………………………45
1-4-4- اثر غلظت های مختلف IBA و IAA بر درصد ریشه زایی……………………………………………………………………..47
2-4-4- اثر غلظت های مختلف IBA و IAA بر طول ریشه……………………………………………………………………………….48
فصل پنجم
5- بحث…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………50
1-5- اثرات نوع محیط کشت در باززایی………………………………………………………………………………………………………………..50
2-5- اثرات نوع ریزنمونه در باززایی……………………………………………………………………………………………………………………….52
3-5- اثرات ژنوتیپ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55
4-5- ریشه زایی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………57
نتیجه گیری کلی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..60
پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………62
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-4- نتایج تجزیه واریانس اثرات نوع محیط هورمونی…………………………………………………………………………………….32
جدول 2-4- نتایج تجزیه واریانس اثرات نوع ریزنمونه در زنیان………………………………………………………………………………….37
جدول 3-4- نتایج تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه……………………………………………………………………………………………….42
جدول 4-4- نتایج تجزیه واریانس درصد ریشه دهی و طول ریشه در پاسخ به تیمارهای هورمونی………………………….46
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-4- غلظت های مختلف هورمونی بر میانگین باززایی شاخساره در زنیان………………………………………………………35
شکل 2-4- تأثیر تنظیم کننده های رشد روی باززایی شاخساره در ریزنمونه های مختلف گیاه زنیان…………………….40
شکل 3-4- مقایسه محیط های مختلف از لحاظ ریشه زایی در گیاه زنیان……………………………………………………………….49
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 1-4- تأثیر غلظت های مختلف هورمونی بر درصد باززایی شاخساره…………………………………………………………33
نمودار2-4- تأثیر غلظت های مختلف هورمونی بر میانگین باززایی شاخساره………………………………………………………34
نمودار 3-4- تأثیر غلظت های مختلف هورمونی بر درصد باززایی شاخساره…………………………………………………………38
نمودار 4-4- تأثیر غلظت های مختلف هورمونی بر میانگین باززایی شاخساره………………………………………………………39
نمودار 5-4- تأثیر ژنوتیپ های مختلف و محیط هورمونی بر درصد باززایی شاخساره…………………………………………..43
نمودار 6-4- تأثیر ژنوتیپ های مختلف و محیط هورمونی بر میانگین باززایی شاخساره……………………………………….44
نمودار 7-4- تأثیر تیمارهای مختلف هورمونی بر درصد ریشه زایی ریزنمونه ها……………………………………………………47
نمودار 8-4- تأثیر تیمارهای مختلف هورمونی بر درصد ریشه زایی ریزنمونه ها……………………………………………………48
فصل اول
مقدمه و کلیات
1-1- گیاهان دارویی1
از زمانهای قدیم، انسانها از گیاهان به عنوان غذا، طعم دهنده، دارو و کاربردهای دیگر استفاده می کردند. نوشته های باستان از فرهنگ ها و تمدن (مصری، چینی و رومی) شواهد قوی در مورد استفاده از گیاهان دارویی جهت درمان بیماریها وجود دارد. بر اساس گزارش سازمان جهانی بهداشت (WHO)، 80 درصد از مردم کشورهای در حال توسعه جهان، از گیاهان دارویی برای مراقبت های بهداشتی استفاده می کنند. حدود 40 درصد از ترکیبات استفاده شده در صنعت داروسازی بطور مستقیم یا غیر مستقیم از گیاهان مشتق می شود (Sidhu, 2010). امروزه گیاهانی به عنوان گیاهان دارویی شناخته می شوند که دارای صفات زیر باشند:
1- در پیکر این گیاهان مواد خاصی ساخته و ذخیره می شود به نام “مواد مؤثره2″ (مواد فعال)، که این مواد تأثیر فیزیولوژیکی بر پیکر موجود زنده بر جای می گذارند. این گیاهان برای مداوای برخی از بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرند. مواد فعال مذکور در طی یک سلسله فرایندهای ویژه و پیچیده بیوشیمیایی، به مقدار بسیار کم- معمولاً کمتر از وزن خشک گیاه- ساخته می شوند و به ” متابولیتهای ثانوی3″ نیز معروفند.
1- Medicinal plants
2- Active substances
3- Secondary metabolites
2- کاشت، داشت و برداشت گیاهان دارویی، صرفاً به خاطر استفاده از مواد مؤثره آنها صورت می گیرد.
3- ممکن است اندام خاصی چون ریشه، ساقه، برگها، گل و… حاوی مواد مؤثره مورد نظر باشند. از این رو، نمی توان تمام اندامهای گیاه مربوط را منبع ماده دارویی مورد نظر دانست.
4- معمولاً از اندامهای مورد نظر بصورت تازه استفاده نمی شود.
5- گیاهان دارویی حاوی مواد مؤثره، در مقایسه با عموم گیاهان مورد عمل در کشاورزی چون غلات و سبزی ها که بطور عام و روزمره مورد استفاده انسان هستند، در موارد خاصی قابل استفاده اند (امید بیگی، 1384).
2-1- کشت بافت به کشت قطعه ای از بافت گیاه در شرایط آزمایشگاهی و کاملاً استریل گفته می شود که در نهایت از این قطعه، یک گیاه کامل بدست می آید.
– برخی از کاربردهای کشت بافت در باغبانی:
1) تولید گیاهان عاری از ویروس و بیماری
2) تکثیر و ریزازدیادی گیاهان (Micropropagation)
3) تولید گیاهان هاپلوئید و سپس دیپلوئید کاملاً هموزیگوس از طریق کشت میکروسپور یا بساک
4) دست ورزی ژنتیکی و دورگ گیری سوماتیکی با استفاده از الحاق پروتوپلاسمی و همچنین ایجاد تلاقی بین گونه ای در شرایط درون شیشه ای
5) کشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت های اولیه مثل قند و کربن و نیز متابولیت های ثانویه
6) ایجاد گیاهانی با خصوصیات جدید با استفاده از تنوع سوماکلونال
7) نجات جنین با استفاده از کشت جنین های نارس در تلاقی بین گونه ای
8) نگهداری ژرم پلاسم گیاهان در شرایط درون شیشه ای
9) استفاده از کشت بافت در انتقال ژن به گیاه
10) استفاده در مطالعات بافت شناسی، سلول شناسی و فیزیولوژی گیاهی (باقری و صفاری، 1388).
3-1- خصوصیات گیاهشناسی زنیان
زنیان در کتب طب سنتی با نام های مختلف نانخواه (به دلیل استفاده آن در پخت نان)، آنیسون بری و بادیان رومی، با اسامی انگلیسی Ajowan، Ajowain، Bishop weed و Carum و نام های علمی Trachyspermum ammi و Carum copticum که مترادف یکدیگر هستند، آورده شده است و از تیره چتریان (Apiaceae) می باشد (اکبری نیا و همکاران، 1384). Trachyspermum ammi L.، کلمه ای یونانی متشکل از دو کلمه Trachy به معنای خشن و spermum به معنای بذر دار می باشد، در حالیکه ammi نام گیاه به زبان لاتین و مترادف Carum copticum است (Dwivedi et al., 2012). زنیان گیاهی یکساله با ارتفاع کمتر از 1 متر، پر شاخه و برگ، برگ های بریده بریده و نخی شکل است. گل ها با گلبرگ های سفید و کوچک و پرچم های صورتی رنگ، میوه کوچک و دارای 5 خط طولی نازک، معطر و دارای طعمی تند و نافذ است و به اندازه و شکل کرفس دارویی بوده، اما طعم آن متفاوت است ( مجنون حسینی و دوازده امامی، 1386).
وزن هزاردانه آن 1 تا 2 گرم و این گیاه در مرحله رویشی شباهت بسیاری به شوید دارد. در مرحله گرده افشانی حشرات زیادی جلب گلها شده و گرده افشانی توسط زنبورها انجام می پذیرد. گلدهی از اوایل بهار در مناطق گرم و اواخر بهار در مناطق معتدل شروع می شود و همزمان با رشد رویشی ادامه می یابد. با ظهور گلها، رشد طولی ساقه ها متوقف شده و رشد جانبی شروع می گردد. بنابراین می توان گفت که زنیان گیاهی است که رشد نامحدود دارد ( اکبری نیا، 1382 و 1999 . (Krishnamoorthy et al., تعداد کروموزوم های زنیان 2n=2x=18 می باشد (Dalkani et al., 2010).
4-1- تاریخچه و پراکنش گیاه زنیان
در کتاب قانون ابو علی سینا، زنیان تحت نام نانخواه عنوان شده که این گیاه رطوبت معده را برمی چیند و دل به هم آمدن و تهوع را تسکین می دهد و برای کبد و معده سرد نیز مفید است. در طب سنتی عربستان سعودی دانه خشک شده این گیاه در اختلالات گوارشی به عنوان بادشکن و هضم کننده استفاده می شود (حسین زاده و محرابی، 1382). در هند و افغانستان، بعنوان طعم دهنده در غذاهای آماده و سرپایی، کنسرو لوبیا و انواع نان بکار می رود (مجنون حسینی و دوازده امامی، 1386). منشأ گیاه زنیان در آسیا بوده و در کشورهای هند، ایران و مصر می روید و یا کشت می شود (اکبری نیا و همکاران، 1384). در اطراف مدیترانه، جنوب شرقی آسیا، افغانستان و مصر هم کشت می شود ولی عمدتاً در هند وجود دارد (Wahab et al., 2008). زنیان در ایران، در شهرهای بلوچستان، تبریز، اصفهان، خوزستان، کرمان، تربت حیدریه و سیستان می روید ( معاونی، 1388).
5-1- نیازهای اکولوژیکی زنیان
زنیان گیاهی است که در طول رویش خود به آب و هوای گرم و آفتابی کامل نیاز دارد. زنیان برای جوانه زنی به دمای 20 الی 25 درجه سانتیگراد و در مرحله ساقه دهی تا گلدهی به مقدار کافی آب نیاز دارد. آبیاری منظم باعث افزایش عملکرد بذر و مقدار اسانس می شود. چنانچه در طول رویش آب کافی در دسترس گیاهان نباشد، عملکرد بذر به میزان قابل توجهی کاهش می یابد. خاک های سبک و تهی از مواد غذایی و همچنین خاک های سنگین رسی برای کشت زنیان مناسب نیست. pH مناسب برای این گیاه بین 5/6 تا 2/7 می باشد (معاونی، 1388). زنیان از متحمل ترین گیاهان دارویی نسبت به شوری محسوب می شود. همچنین به خاک های قلیایی تحمل خوبی دارد. این گیاه با تراکم بالا قابل کشت بوده، بنابراین برای مقابله با علف های هرز می توان از آن استفاده کرد (مجنون حسینی و دوازده امامی، 1386).
6-1- ترکیبات شیمیایی گیاه
قسمت مورد استفاده زنیان در طب سنتی دانه (بذر) آن است. بذور زنیان بطور کلی حاوی 4/7 درصد رطوبت، 1/17 درصد پروتئین، 8/21 درصد چربی، 9/7 درصد مواد معدنی، 2/21 درصد فیبر و 6/24 درصد کربوهیدرات در هر 100 گرم می باشد (Dwivedi et al., 2012).
اسانس بذر زنیان از فنول ها و ترپن ها تشکیل شده است و حاوی بیش از 27 ترکیب است که تیمول (61 درصد) جزء اصلی آن و ترکیبات مهم دیگر آن پاراسیمن (6/15 درصد)، آلفا- ترپینن (9/11 درصد)، بتا- پینن (5-4 درصد)، دی پینن (6-4 درصد)، کامفن و میرسن می باشد. اسانس آن علاوه بر تیمول حاوی یک هیدروکربن مایع که سیمول یا کریمین نامیده می شود نیز می باشد. احتمال دارد که اسانس حاوی هیدروکربن دیگری باشد که با تورپنتین اسانس ایزومریک می باشد (Malhotra and Vijay, 2004). زنیان همچنین حاوی کاتیونهایی شامل سدیم، پتاسیم، آهن، کلسیم، منیزیوم و روی است (میرحیدر، 1380). Saharkhiz و همکاران (2005)، اثرات مراحل مختلف برداشت (مراحل خمیری و رسیدگی بذر) را روی محتوی و ترکیب اسانس بذر زنیان کشت شده در ایران مطالعه کردند. محتوی اسانس میوه های برداشت شده در مراحل خمیری و رسیدگی به ترتیب 1/7 درصد و 2/3 درصد بدست آمد. ترکیبات اصلی در اسانس میوه هایی که در مرحله خمیری برداشت شدند شامل آلفا-ترپینن 2/43 درصد و تیمول 4/32 درصد و پاراسیمن 7/20 درصد، در حالی که ترکیبات اصلی اسانس میوه هایی که در مرحله رسیدگی برداشت شدند به ترتیب شامل تیمول 7/36 درصد، آلفا- ترپینن 5/36 درصد و پارا- سیمن 1/21 درصد بود.
7-1- خواص درمانی
در طب سنتی از بذور و ریشه گیاه زنیان استفاده فراوان می شود. به عنوان بادشکن (ضد نفخ)، تونیک و زیاد کننده تنفس، مداوای ترش کردن معده بکار می رود (مجنون حسینی و دوازده امامی، 1386). همچنین بطور سنتی، عصاره زنیان جهت فرونشاندن علائم آنفلوانزا در کودکان استفاده می شود (Goudarzi et al., 2011). در طب مدرن به عنوان ضد عفونی کننده قوی، تقویت هاضمه، و در مصرف خارجی به منظور درمان رماتیسم استفاده می شود. عصاره بذر زنیان در داروهای ضد سرفه و مشتقات آپوکسی به کار می رود. در هند و افغانستان به عنوان طعم دهنده در غذاهای آماده و سرپایی، کنسرو لوبیا و تهیه انواع نان به کار می رود (مجنون حسینی و دوازده امامی، 1386). تیمول، ترکیب فنلی فراوان موجود در زنیان است که میکروب کش، ضد اسپاسم، ضد قارچ (Wadhwa, 2010) و اثر کاهش دهنده فشار خون را دارد و در درمان بیماری های پوستی مانند آکنه و درماتیت همراه سایر ترکیبات فنلی کاربرد دارد (Srivastava, 1999). عصاره الکلی زنیان شامل ساپونین با شاخص 500، فلاونوئید زرد کریستاله و یک ماده استروئیدی است که به عنوان ضد میکروب بر 9 گونه باکتری گرم مثبت و گرم منفی مؤثر است (Sadananda, 2000; Srivastava, 1999). همچنین عصاره الکلی زنیان به عنوان آنتی هیستامین کاربرد دارد (Boskabady, 2000). همچنین زنیان در رفع بیماری های معده و کبد، محرک، مقوی معده، بادشکن، مقوی، ضد اسپاسم، ضد عفونی کننده، ضد تهوع، مقوی قوه باء، ضد کرم و مدر است ( معاونی، 1388).
8-1- کشت بافت گیاهی
با توجه به اینکه امروزه روش های قدیمی و کلاسیک تکثیر و اصلاح گیاهان به تنهایی جوابگوی بسیاری از نیازها نمی باشد، لازم است روش های جدیدتری جایگزین یا تکمیل کننده روش های قبلی مورد استفاده قرار گیرد. مناسب ترین راه برای نیل به این هدف، استفاده از روش های زیست فن آوری می باشد (مشایخی، 1386). کشت بافت گیاهی، به تکثیر و رشد سلولها، بافت ها و اندام های گیاهان اطلاق می شود که در محیط های جامد یا مایع، تحت شرایط استریل و در شرایط محیطی کنترل شده باشند. کشت بافت گیاهی به مفهوم توتی پوتنسی وابسته است که به توانایی سلولها و بافت های گیاهی جهت نمو به گیاه جدید کامل می باشد (Sidhu, 2010). در سال 1838 شوان وشلیدن تئوری توتی پوتنسی را ارائه نمودند که بر اساس این تئوری، هر سلول، مستقل بوده و در اصل قادر به تولید یک گیاه کامل است. در واقع تئوری آنها، پایه و اساس کشت بافت و سلول گیاهی بود (Pieric, 1979). اولین تلاش به وسیله Haberlandt، گیاهشناس آلمانی که بعنوان پدر کشت بافت گیاهی شناخته شد، صورت گرفت که سلولهای گیاهی را جدا و در محلول نمک Knops در سال 1898 کشت کرد (Krikorian, 1969)، ولی او در روش کشت بافت، ناموفق بود. معذالک هاریون، باروز و کارل (1909-1907)، موفق به کشت درون شیشه ای بافت های حیوانی و انسانی، شدند. گرچه محققین تحقیقاتی را در ارتباط با کشت درون شیشه ای، در مورد بذور گیاهچه های ارکیده، جنین و اندام های گیاهی، انجام دادند ولی نوبکرت، گوستریت و وایت (1939)، برای اولین بار موفق به تولید گیاه حاصل از کشت بافت، شدند (Pierik, 1979). کشت بافت های گیاهی، از قطعات کوچک که به آنها ریزنمونه گفته می شود و از بخش های مختلف گیاه گرفته می شود، آغاز می شود. به طور کلی، همه بخش های گیاه به عنوان منبع ریزنمونه بطور موفقیت آمیزی استفاده شده اند.
9-1- کاربردهای کشت بافت گیاهی در کشاورزی
• تکثیر کلونی سریع و در مقیاس وسیع گیاهان یکسان از یک منبع گیاهی برتر
• حذف عوامل بیماری زا، همچنین تسهیل انتقال ماده گیاهی از راه مرزهای بین المللی
• تهیه منابع عاری از بیماری به صورت کشت درون شیشه ای
• ذخیره ژرم پلاسم و ذخیره بلند مدت منابع گیاهی
• گزینش از جهش های خود بخودی یا القایی
• تولید ریز قلمه های ریشه دار شده در گونه های زینتی چوبی سخت ریشه زا
• بازیابی دورگها از گونه های ناسازگار توسط کشت رویان یا تخمک
• تولید گیاهان هاپلوئید: با استفاده از کشت بساک گیاهان هاپلوئید برای بازیابی جهش های مغلوب در برنامه های اصلاحی استفاده می شود. باززایی متوالی، باعث تولید هاپلوئید های مضاعف شده، هموزیگوس شده و بنابراین لاین های اصلاحی خالص فراهم می شوند ( آزادی و باقری، 1382).
10-1- روش های مختلف کشت بافت گیاهی
هر گیاه، شامل اندام های متفاوتی است، که هر یک از این اندامها از معدودی بافت تشکیل شده اند و بافت ها به نوبه خود از سلولهای اختصاصی به وجود آمده اند. اگر دیواره این سلولها توسط آنزیم هضم شوند، پروتوپلاست حاصل می شود. از آن جایی که گیاه، از مواد ساختمانی بسیار متفاوتی تشکیل شده است، انواع مختلفی از کشت درون شیشه نیز وجود دارد.
1- کشت گیاه کامل: یک بذر ممکن است در شرایط درون شیشه کشت شود و یک گیاهچه و در نهایت یک گیاه کامل تولید کند.
2- کشت اندام گیاهی: یک اندام جدا شده، در شرایط درون شیشه ای رشد می کند. در کشت اندام، انواع مختلفی مثل کشت مریستم، کشت نوک ساقه، کشت ریشه ، کشت پرچم قابل تشخیص هستند.
3- کشت جنین1: پس از حذف پوسته بذر ، جنین جدا شده و کشت می شود.
4- کشت کالوس2: اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در شرایط درون شیشه تولید یک توده تمایز نیافته به نام کالوس نماید، این پدیده را کشت کالوس می نامند.
5- کشت سلول3: کشت سلول های منفرد که به کمک آنزیمها یا به روش های مکانیکی از یک بافت گیاهی، کالوس یا سوسپانسیون سلولی به دست می آیند، کشت سلول نامیده می شود.
4- کشت پروتوپلاست4: کشت پروتوپلاستهایی که در اثر هضم آنزیمی دیواره سلول بوجود آمده اند، کشت پروتوپلاست می نامند (باقری و صفاری، 1388).
11-1- ریزازدیادی5
ریزازدیادی فرایند رشد رویشی و تکثیر از بافت یا دانه گیاهان می باشد. ریزازدیادی با استفاده از حداقل فضا و مکان، شرایط مناسبی را برای رشد گیاهان ایجاد می کند. مزایای استفاده از ریزازدیادی به شرح زیر است:
1- مقادیر بالای تکثیر
2- کنترل محیط و فراهم کردن احتیاجات گیاه
3- در دسترس بودن گیاه در تمام طول سال (مستقل از تغییرات منطقه ای و فصلی)
4- شناسایی و تولید کلون ها با ویژگی های مورد نظر
1- Embryo culture
2- Callus culture
3- Cell culture
4- Protoplast culture
5- Micropropagation
5- تولید متابولیت های ثانویه
6- حفاظت از گونه های در معرض انقراض
7- حفاظت از مواد ژنتیکی با روش های حفاظت انجمادی
به منظور استفاده از تکنیک ریزازدیادی روش های مختلفی مانند کشت کالوس، کشت سوسپانسیون سلولی، جنین زایی سوماتیکی و کشت پروتوپلاست استفاده می شود (Sidhu, 2010).
12-1- تمایز سلولی
سلولهای بافت کالوس طبیعت پارانشیمی دارند. در طی تمایز به یک گیاه کامل، این سلولها بایستی به انواع مختلفی از سلولها تمایز یابند که این پدیده به تمایز سلولی معروف می باشد. در گیاه عادی تمایز بافت ها به طور مشخص با توجه به خصوصیات اندام و گونه گیاه ادامه می یابد. معذالک کشت های کالوس از آنجا که فاقد عناصر آوندی هستند، برای مطالعه تأثیر انواع مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی در تمایز بافت آوندی، سیستمی ارزشمند به شمار می آیند. اکسین و ساکارز تأثیر عمده ای بر تمایز بافت های آوندی دارند، در حالیکه سیتوکینین ها و جیبرلین ها تمایز بافت آوندچوبی را سرعت می بخشند. عموماً اکسین در غلظت پایین (5/0 میلی گرم در لیتر) تولید آوند چوبی را تحریک نموده و ارتباط معکوسی بین غلظت اکسین و میزان تمایز بافت آوند چوبی وجود دارد. بعلاوه مشاهده شده است که تأثیر اکسین بر تمایز بافت آوندی به حضور قندها بستگی دارد. همچنین فاکتورهای فیزیکی نظیر دما و درجه حرارت تأثیر شناخته شده ای بر تمایز بافت آوندی دارد (فارسی، 1384).
13-1- تمایز اندام
در طبیعت، خاصیت توانمندی سلولهای سوماتیکی در گیاهان مختلف دیده شده است. به طوری که قطعات بزرگ ساقه و ریشه قادرند در اثر تمایز ساقه و ریشه تولید کنند. مطالعات در شرایط درون شیشه ای نشان داده است که خاصیت توانمندی سلولی به چند گونه اندک محدود نمی باشد و اغلب گونه های گیاهی اگر در شرایط مناسب قرار گیرند، تمایز نشان خواهند داد. برای باززایی یک گیاه کامل از یک سلول یا بافت کالوس، تمایز سلولی کفایت نمی کند و تمایز بایستی به شکل گیری جوانه ساقه یا جنین منجر شود. این امر با اندام زایی1 یا جنین زایی رویشی تحقق می یابد. در اندام زایی، یک ساختار تک قطبی که متصل به بافت آوندی اولیه درون کالوس است تشکیل می شود ولی در جنین زایی یک ساختار دو قطبی بدون هیچ گونه اتصال آوندی با بافت کالوس مادری یا ریزنمونه شکل می گیرد (فارسی، 1384).
14-1- اندام زایی
در کشت بافت گیاهی، اندام زایی فرایندی است که طی آن اندام های گیاهی نظیر ساقه، ریشه، جوانه گل و غیره تولید می شوند. این فرایند عبارت است از تولید اندام ها و جنین های گیاهی ( ساختارهایی شبه جنین) از نقاطی غیر عادی نسبت به بافت مادری بر روی یک ریزنمونه سازمان یافته که فاقد هرگونه سیستم از قبل تشکیل شده می باشد. ساقه ها و ریشه های نابجا از بافت هایی منشأ می گیرند که در حالت طبیعی این اندام ها را تولید نمی نمایند. ساقه های نابجا، ساختارهایی متشکل از ساقه و برگ هستند که از بافت های گیاهی در مکانهایی غیر از زاویه برگ منشأ می گیرند. گیاه کامل باززایی شده با این روش، یک ساختار تک قطبی می باشد. این گیاه یک سری رشته های پروکامبیومی2 تولید می نماید که این رشته ها با شبکه آوندی موجود گسترش یافته در بافت کالوس یا ریزنمونه کشت شده ارتباط برقرار می نماید. فرایند اندام زایی از جنین زایی سوماتیکی متداول تر است و در تکثیر رویشی به صورت انبوه، پتانسیل خیلی بیشتری دارد. تولید گیاه به روش اندام زایی به دو طریق امکان پذیر است:
1- اندام زایی از بافت کالوس
2- اندام زایی به طور مستقیم از ریزنمونه (فارسی، 1384).
1- Organogenesis
2- Procambium
1-14-1- اندام زایی از بافت کالوس
باززایی گیاه از ریزنمونه های کشت شده، مستلزم تولید کالوس و سپس تمایز جوانه ساقه از این بافت کالوس می باشد. ایجاد ساقه، ریشه، گل آذین جوان، گلبرگ ها و جنین در شرایط درون شیشه ای صورت می گیرد. برای باززایی موفق گیاه در هر گونه و یا رقم ویژه ممکن است به ریزنمونه خاصی نیاز باشد. ریزنمونه های حاصل از اندام های بالغ و نابالغ را می توان در تهیه کالوس و سپس باززایی گیاه، مورد استفاده قرار داد.با این حال معمولاً ریزنمونه های دارای سلول های فعال میتوزی، برای تولید کالوس مناسب تر هستند. بافت ها و اندام های نابالغ در کشت درون شیشه ای از نظر ظاهری نسبت به بافت های بالغ انعطاف پذیرترند. اندازه و شکل ریزنمونه نیز مهم است. درصد کمی از سلول های ریزنمونه در تشکیل کالوس شرکت می نمایند. محل تشکیل کالوس معمولاً در سطح پیرامون ریزنمونه و یا در سطح بریده شده است. بافت کالوس در اثر ایجاد زخم و یا در پاسخ به هورمون های اضافه شده در محیط کشت ایجاد می شود. برای انتخاب ریزنمونه بایستی اندام های مریستمی نظیر نوک ساقه، جوانه جانبی، گل آذین، ساقه، برگ، دمبرگ و ریشه، بر سایر بافت ها ترجیح داده شوند، چرا که این بافت ها دارای خصوصیات ارزشمندی نظیر خصوصیات کلونی، بقاء کشت، سرعت رشد و خاصیت توانمندی سلولی در کشت های درون شیشه می باشند. مریستم ها، نوک ساقه ها و جوانه های جانبی، برگ ها و جنین های نابالغ، به ویژه در غلات ریزنمونه های خوبی هستند. ریزنمونه هایی نظیر برگ های بالغ، ریشه، دمبرگ و اجزای گل، می توانند با موفقیت برای تولید گیاهچه به روش اندام زایی مورد استفاده قرار گیرند. فصل سال، سن و وضعیت فیزیولوژیکی گیاه دهنده ریزنمونه نیز در موفقیت اندام زایی نقش دارند. محیط کشت های مختلفی از جمله MS1، B52، وایت3 و SH4 برای اندام زایی مورد استفاده قرار می گیرند. محیط کشت MS بر خلاف محیط های دیگر، محتوی مقادیر زیادی نیتروژن آمونیومی می باشد.در روش اندام زایی معمولاً از دو نوع کشت سلولی استفاده می شود:
1- Murashig and skoog
2- Gamborg B5 medium
3- White
4- Schenk and Hilderandt
1- کشت توده های سلولی در سطح محیط کشت جامد
2- کشت تعلیق سلولی در محیط کشت مایع
غلظت مواد تنظیم کننده رشد در محیط کشت برای اندام زایی بسیار مهم است. اکسین با غلظت متوسط تا زیاد اولین هورمون مورد استفاده برای تولید کالوس است. غالباً از هورمون 2,4-D که اکسین بسیار نیرومندی است، به تنهایی برای القای کالوس استفاده می شود. در بعضی از گونه ها غلظت زیاد اکسین و غلظت کم سیتوکینین در محیط کشت، روند تولید کالوس را تسریع می کند. سیتوکینین های مورد استفاده کینتین یا BAP می باشند. بافت کالوس متشکل از گستره وسیعی از انواع سلول های واکوئل دار با تمایز نامنظم است که تعداد کمتری سلول های مریستمی در بین آنها پراکنده می باشد. ماهیت بافت کالوس به بافت ریزنمونه و یا بافت هایی که ریزنمونه از آن منشأ گرفته است و همچنین ترکیب محیط کشتی که برای تولید و نگهداری آن بکار می رود، بستگی دارد. کالوس را می توان با تهیه واکشت های مکرر برای مدت زمان طولانی نگه داشت، اما ترکیب و ساختار آن ممکن است به مرور زمان تغییر کند. چرا که محیط کشت به نفع سلول های معینی عمل نموده و باعث غالب شدن آنها می شود. تحت شرایط رشد مناسب برای رشد سازمان نیافته، سلول های مریستمی به طور تصادفی و پراکنده در بافت کالوس قرار دارند. انتقال قطعات کالوس به شرایطی که موجب رشد سازمان یافته شود، به تشکیل مریستموئیدها که مراکز رشد نیز نامیده می شوند، می انجامد. مریستموئیدها، توده های متمرکزی از سلولهای شبه کامبیومی هستند که ممکن است به دلیل ظهور سلولهای تراکئیدی در مرکز، به آوند مجهز شوند. این توده ها محل تشکیل اندام در بافت کالوس بوده و قادر به تولید ساقه یا ریشه می باشند. اندام زایی هم از کشت تعلیق سلولی و هم از کشت های کالوس امکان پذیر است. فقط لازم است سلول ها را از محیط کشت کالوس به محیط کشت خاص باززایی انتقال داده و سپس بطور مرتب در محیط باززایی تجدید کشت نمود (فارسی، 1384).
2-14-1- اندام زایی نابجا به طور مستقیم
بافت های رویشی گیاهان عالی تحت شرایط ویژه قادر به تولید گیاهان نابجا می باشند. جوانه های نابجا، جوانه هایی هستند که مستقیماً از یک اندام گیاهی یا یک قطعه متعلق به آن و بدون نیاز به کالوس ( به عنوان مرحله حد واسط) منشأ می گیرند. تولید ساقه های نابجا به طور مستقیم بر روی ریشه، برگ و فلس های پیاز، یکی از روش های مرسوم تکثیر گیاهان است. در محیط کشت نیز این روش بویژه برای گیاهان علفی مناسب است. تشکیل اندام های نابجا به فعالیت مجدد ژن های مرتبط با فاز جنین زایی و نمو بستگی دارد (فارسی، 1384).
15-1- هدف از انجام این تحقیق
در میان گیاهان دارویی و معطر، زنیان گیاهی است که مطالعات و تحقیقات کمی بر روی آن انجام گرفته است. با توجه به اهمیت گیاه زنیان و لزوم شناخت روش های تکثیری آن و همچنین شناخت بهترین، سریع ترین و اقتصادی ترین روش تکثیر آن در شرایط درون شیشه ای، تحقیق حاضر به منظور شناسایی اثرات ژنوتیپ، تعیین بهترین ریزنمونه، بهترین ترکیب هورمونی و شرایط مناسب محیطی، جهت کشت درون شیشه ای زنیان و همچنین دانش فنی کشت درون شیشه ای آن در ایران انجام گرفته است. در این پژوهش، تکثیر این گیاه از طریق باززایی مستقیم با استفاده از بنزیل آمینو پورین (BAP) و ایندول استیک اسید (IAA) و تیدیازورون (TDZ) مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته است.
فصل دوم
بررسی منابع علمی
1-2- ریزازدیادی
ریزازدیادی فرایند رشد رویشی و تکثیر از بافت یا دانه گیاهان می باشد که با استفاده از حداقل فضا و مکان، شرایط مناسبی را برای رشد گیاهان دارویی فراهم می کند. ریزازدیادی تکنیک مهمی است که در گیاهان دارویی به منظور تولید متابولیت های ثانویه ای که به طریقه شیمیایی نمی توان آنها را سنتز کرد، بکار برده می شود



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه

پاسخ دهید